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蛋白質(zhì)/多肽液相分析中的流動(dòng)相選擇有機(jī)溶劑可將吸附在疏水界面的蛋白質(zhì)洗脫（圖14）。在梯度洗脫期間，當(dāng)有機(jī)溶劑量達(dá)到針對(duì)每一蛋白質(zhì)的特定濃度時(shí)，蛋白質(zhì)就會(huì)從疏水界面上解吸，繼續(xù)順著柱向下，從而從柱中洗脫。圖14.當(dāng)有機(jī)改性劑的濃度達(dá)到特定值時(shí)，蛋白質(zhì)從疏水界面洗脫。乙腈。在多肽的反相色譜分離時(shí)常用的有機(jī)溶劑為乙腈。為什么選擇乙腈？乙腈易揮發(fā)，易從樣品中去除。乙腈黏度低，柱壓低。乙腈的紫外吸收截止波長較短。乙腈長期用于分離應(yīng)用。異丙醇。異丙醇在多肽的色譜分離中具有重要作用。盡管異丙醇黏度大（會(huì)增大
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蛋白質(zhì)/多肽液相分析中的流動(dòng)相選擇有機(jī)溶劑可將吸附在疏水界面的蛋白質(zhì)洗脫（圖14）。在梯度洗脫期間，當(dāng)有機(jī)溶劑量達(dá)到針對(duì)每一蛋白質(zhì)的特定濃度時(shí)，蛋白質(zhì)就會(huì)從疏水界面上解吸，繼續(xù)順著柱向下，從而從柱中洗脫。圖14.當(dāng)有機(jī)改性劑的濃度達(dá)到特定值時(shí)，蛋白質(zhì)從疏水界面洗脫。乙腈。在多肽的反相色譜分離時(shí)常用的有機(jī)溶劑為乙腈。為什么選擇乙腈？乙腈易揮發(fā)，易從樣品中去除。乙腈黏度低，柱壓低。乙腈的紫外吸收截止波長較短。乙腈長期用于分離應(yīng)用。異丙醇。異丙醇在多肽的色譜分離中具有重要作用。盡管異丙醇黏度大（會(huì)增大
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選擇合適的色譜柱微粒。通過與柱內(nèi)填充微粒疏水表面的相互作用實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)與多肽的分離。柱內(nèi)填充粒通常以硅膠為基礎(chǔ)，這是因?yàn)楣枘z的穩(wěn)定性高，能夠在大多數(shù)溶劑條件下（除了pH大于6.5的情況）保持穩(wěn)定，此外，硅膠可以形成各種大小的具有不同直徑的多孔球形顆粒。硅膠純度。液相色譜柱所用硅膠填料的純度對(duì)分離性能至關(guān)重要。金屬離子雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致峰拖尾和分辨率下降，如圖7A所示（0.01%和0.005%的TFA）。含金屬離子雜質(zhì)（圖7A）的硅膠需要采用高濃度離子對(duì)試劑（如三氟yi酸（TFA））維持良好的峰形。圖7.硅
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引言反相HPLC已成為分離和分析蛋白質(zhì)和多肽的重要工具。它在生物技術(shù)行業(yè)中被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)類治療產(chǎn)品的表征，以及這些產(chǎn)品和雜質(zhì)的鑒定。在通過質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)之前，反相HPLC在從消化后的蛋白質(zhì)組中分離多肽方面有著至關(guān)重要的作用。它也被用于探索性研究中多種蛋白質(zhì)和多肽的純化，以及蛋白類治療藥物的大規(guī)模純化。反相HPLC靈敏、通用性強(qiáng)，還可與質(zhì)譜等技術(shù)結(jié)合使用，在蛋白質(zhì)研究中具有重要的地位。此外，它還能夠分離結(jié)構(gòu)近乎相同的蛋白質(zhì)，因而得到了廣泛的應(yīng)用。正如牛、人和豬胰島素變異體的分離過程所示（圖1）
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菲羅門與ACE色譜柱的保養(yǎng)方法色譜柱是一種消耗品，因此使用壽命有限。對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用，色譜柱應(yīng)持續(xù)進(jìn)行500-2000次注射（進(jìn)樣），但這會(huì)因樣品的清潔度、流動(dòng)相的pH值和保護(hù)柱卡套的使用（是否使用保護(hù)柱）而不同。這里列出的做法有助于大限度地提高硅基（硅膠基質(zhì)）色譜柱的使用壽命。一、色譜柱的平衡：當(dāng)從一個(gè)流動(dòng)相更換為另一個(gè)流動(dòng)相時(shí)，或者在回收梯度（梯度循環(huán)）時(shí)，應(yīng)需要10-20個(gè)柱體積。下表顯示了各種色譜柱尺寸（規(guī)格）的色譜柱體積。如果溶劑的變化不太劇烈（例如80％至20％的ACN/水與ACN至T
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3.鬼峰問題鬼峰問題預(yù)防措施和解決方案鬼峰柱或注射器被污染（色譜柱或進(jìn)樣器污染）僅使用HPLC級(jí)溶劑沖洗柱，以去除雜質(zhì)在注射器用于下一個(gè)分析物時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行沖洗前一個(gè)注射導(dǎo)致的遲洗脫峰（前一次進(jìn)樣的后洗脫峰）延長運(yùn)行時(shí)間每次運(yùn)行結(jié)束時(shí)用強(qiáng)流動(dòng)相沖洗色譜柱對(duì)于梯度運(yùn)行，應(yīng)以較高濃度結(jié)束（有機(jī)相比例結(jié)束梯度）在RPHPLC中，水被污染1.使用HPLC級(jí)水樣本中的未知（未知雜質(zhì)）干擾1.使用樣品清理（凈化措施）（例如SPE）負(fù)峰溶質(zhì)折射率低于流動(dòng)相（RI檢測器）使用折射率較低的流動(dòng)相調(diào)換檢測器極性以獲得
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2.保留時(shí)間問題可能致因預(yù)防措施/解決方案減少保留時(shí)間鍵合固定相的損失（流失）更換柱（更換色譜柱）在pH值為2-8的硅基（硅膠基質(zhì)）RP柱上操作固定相上的（存在）活性基團(tuán)在流動(dòng)相中使用有機(jī)改性劑增加緩沖強(qiáng)度（增加緩沖液離子強(qiáng)度）增加流量（流速）檢查并調(diào)整泵的流量（流速）柱超載（色譜柱過載）減少注入的樣本量（減小進(jìn)樣量）使用具有更大內(nèi)徑的柱（se譜柱）延長保留時(shí)間改變流動(dòng)相的成分覆蓋溶劑容器（蓋緊溶劑瓶）制備新的流動(dòng)相鍵合固定相的損失（流失）更換柱（更換色譜柱）減少流量（流速）檢查并調(diào)整泵的流量（
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峰形問題可能致因預(yù)防措施/解決方案峰拖尾與活性硅醇的相互作用使用超高純度硅基（硅膠基質(zhì)）固定相添加堿性流動(dòng)相添加劑（如TEA）-超高純度相則不需要在固定相中與金屬離子螯合同上錯(cuò)誤的流動(dòng)相pH值（流動(dòng)相pH值不當(dāng)）降低流動(dòng)相pH值以抑制硅烷醇電離增加緩沖液濃度玻璃料阻塞（篩板堵塞）倒沖洗柱（反沖色譜柱）使用串聯(lián)（在線）過濾器柱無效（色譜柱失效）倒沖洗柱（反沖色譜柱）更換柱（色譜柱）死體積未清掃（過大）盡量減少連接器數(shù)量使用較短的連接管檢查所有配件是否緊固分裂峰保護(hù)柱或分析柱入口（進(jìn)樣）端污染拆下保
