Emsdiasum常見問題解答

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Emsdiasum產(chǎn)品-緩沖液

Emsdiasum產(chǎn)品-緩沖液  Emsdiasum常見問題解答

Emsdiasum常見問題解答

我應(yīng)該使用什么樣的粒度？

始終使用最小的顆粒大小來適合您的應(yīng)用?；谳^小顆粒的共軛比基于較大顆粒的共軛更有效。如果使用較小的粒子難以顯示，則可以使用銀增強(qiáng)來放大這些粒子，這是Ultra Small系列共軛物的備條件。新的銀增強(qiáng)系統(tǒng)AURION SE-EM提供均勻高效的增強(qiáng)。

金綴合物真的比其他綴合物更傾向于背景嗎？

不這個(gè)童話故事來源于這樣一個(gè)事實(shí)，即金共軛物是基于粒子的，而可視化也是基于單獨(dú)的粒子的。與酶和熒光標(biāo)記相反，金綴合物更像一個(gè)數(shù)字系統(tǒng)，要么它們?cè)谀抢铮缓竽銜?huì)看到它們，要么它們不存在。酶和熒光標(biāo)記很快被認(rèn)為是“類似物"標(biāo)記，它們?cè)跈z測(cè)中的可見度隨著其局部濃度或酶標(biāo)記產(chǎn)生可見反應(yīng)產(chǎn)物的時(shí)間而增加。對(duì)熒光對(duì)照的無偏見觀察顯示，生物化合物中存在雙鍵所固有的低水平光，最重要的是來自標(biāo)記抗體的熒光。同樣，對(duì)僅用堿性磷酸酶或過氧化物酶標(biāo)記的抗體孵育的對(duì)照樣品進(jìn)行無偏見的觀察，通常會(huì)顯示出樣品的整體染色微弱。這種微弱的水平很容易被接受，甚至在心理上被過濾掉。你不能用金共軛物做這件事，因?yàn)樗鼈兪腔诹Ｗ拥摹?/span>

我應(yīng)該使用二級(jí)金綴合物或蛋白a（或G）嗎？

這取決于你的目標(biāo)是什么。使用次級(jí)綴合物會(huì)產(chǎn)生更高的標(biāo)記密度。因此，人們常說次級(jí)綴合物比蛋白A綴合物更敏感。這在一定程度上是正確的。蛋白質(zhì)A（或G）僅識(shí)別一級(jí)抗體分子上的一個(gè)位點(diǎn)。只有當(dāng)此站點(diǎn)可用且不被其環(huán)境遮擋時(shí)，才會(huì)發(fā)生綁定。次級(jí)綴合物識(shí)別初級(jí)上更多的位點(diǎn)，因此檢測(cè)到初級(jí)抗體的可能性更大。本質(zhì)上，這是靈敏度的提高。

有沒有免疫金（銀）染色的培訓(xùn)計(jì)劃，我可以自己帶標(biāo)本？

EMS和Aurion組織濕式工作坊，您最好使用自己的樣本和初級(jí)抗體。畢竟，這就是你的興趣所在。如果需要，我們將把活動(dòng)擴(kuò)展到其他場(chǎng)地。研討會(huì)持續(xù)兩三天，對(duì)免疫金（銀）染色進(jìn)行了深入探討。參與者人數(shù)有限，以保證最佳教學(xué)。您可以直接聯(lián)系我們了解更多信息。有關(guān)我們研討會(huì)設(shè)置的詳細(xì)信息，請(qǐng)?jiān)L問本網(wǎng)站。

有可能對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行預(yù)包埋標(biāo)記嗎？

對(duì)單細(xì)胞是最合適的。植物材料有一層厚厚的不可穿透的墻，而不是。超小型金綴合物是選的綴合物。在許多情況下，NaBH4的滲透步驟足以打開樣品并允許試劑滲透。低濃度的溫和清潔劑，如皂苷，有助于清潔。需要強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是：必須延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，因?yàn)楸仨殞?shí)現(xiàn)試劑對(duì)內(nèi)部抗原的全滲透。為了在孵育后去除未反應(yīng)的試劑，必須同樣調(diào)整洗滌程序！《Aurion通訊》第5期討論了這個(gè)話題。請(qǐng)參閱本網(wǎng)站的其他地方。

如何驗(yàn)證我的綴合物是否仍然有效？

有一個(gè)簡(jiǎn)單的程序來檢查這一點(diǎn)。它在Aurion的通訊#4中有非常詳細(xì)的描述，一些信息可以在本網(wǎng)站的“通訊"部分找到。簡(jiǎn)而言之：你需要一個(gè)硝基纖維素條，從一級(jí)抗體的稀釋系列中涂上點(diǎn)，然后用金試劑孵育條。這些點(diǎn)會(huì)被較大的共軛物染成紅色。測(cè)試超小型共軛銀時(shí)，必須應(yīng)用銀增強(qiáng)進(jìn)行可視化。

如何驗(yàn)證銀增強(qiáng)試劑是否仍然正常？

同樣，有一個(gè)簡(jiǎn)單的過程來檢查這一點(diǎn)。它在我們的第4號(hào)通訊中有詳細(xì)描述（請(qǐng)參閱本網(wǎng)站的“通訊"部分）。簡(jiǎn)言之：你需要一個(gè)硝基纖維素條，從你的金綴合物的稀釋系列中涂上點(diǎn)，然后用銀增強(qiáng)試劑孵育條。圓點(diǎn)應(yīng)變成棕黑色。在這段時(shí)間內(nèi)，試劑混合物應(yīng)保持玻璃透明，無任何由自成核引起的可見銀存在。

電子顯微鏡用銀增強(qiáng)試劑SE-EM的活性可以通過向100µl增強(qiáng)混合物中加入10µl稀釋的超小型試劑來測(cè)試。溶液應(yīng)在30-45分鐘內(nèi)變黃。

建議使用過時(shí)的共軛詞嗎？

只要它們的反應(yīng)性良好，并且沒有形成太多的團(tuán)簇，這就沒有問題。金共軛物非常穩(wěn)定。隨著時(shí)間的推移，可能會(huì)有一些蛋白質(zhì)從顆粒表面釋放，但通常這不會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)性顯著降低。如通訊#4所述，結(jié)合物的反應(yīng)性很容易通過點(diǎn)點(diǎn)測(cè)試進(jìn)行檢查。根據(jù)結(jié)合蛋白的類型和顆粒大小，簇的形成可能會(huì)隨著時(shí)間的推移而增加。粒子越大，簇越多。這些可以在使用前通過離心稀釋的綴合物來去除。

是否可以使用來自同一動(dòng)物源的兩種抗體進(jìn)行雙重標(biāo)記？

是的，有辦法做到這一點(diǎn)。一種是通過使用具有不同粒徑的蛋白G或蛋白A綴合物。程序是：首先用一級(jí)抗體I孵育，用粒徑較小的蛋白A（或G）檢測(cè)。然后加入過量游離蛋白A或G（50-100µG/ml）孵育。這將幾乎阻斷蛋白A或G的所有結(jié)合位點(diǎn)。接下來，用一級(jí)抗體II孵育第二種抗原，并用更大尺寸的A或G蛋白金綴合物檢測(cè)。第二種可能性是用一級(jí)抗體的混合物進(jìn)行一步孵育，每個(gè)抗體直接用不同的金粒徑標(biāo)記?？商峁┒ㄖ茦?biāo)簽服務(wù)。

我應(yīng)該使用什么樣的網(wǎng)格進(jìn)行銀色增強(qiáng)？

鎳是選材料。黃金網(wǎng)格是不可能的，因?yàn)樗鼈円矊⒈徽R地增強(qiáng)。銅也是如此。無論如何，鎳網(wǎng)格比銅網(wǎng)格更適合免疫培養(yǎng)，因?yàn)殒噷?duì)免疫或酶反應(yīng)更具惰性，毒性更小。鎳網(wǎng)格由于其磁性而令人討厭。通過使用非磁性鑷子或使用電子顯微鏡科學(xué)“美回路"在免疫培養(yǎng)期間將網(wǎng)格從液滴轉(zhuǎn)移到液滴，可以很容易地克服這一問題。

銀增強(qiáng)和OsO4怎么樣？

OsO4固定可在孵育前、孵育后或銀增強(qiáng)后使用。

由于其對(duì)抗原OsO4的破壞作用，當(dāng)打算進(jìn)行免疫培養(yǎng)時(shí)，通常不使用固定。然而，一般來說，銀增強(qiáng)免疫孵育的OsO4固定標(biāo)本不會(huì)造成任何困難。

孵育后可引入鋨固定步驟，以提高樣品的對(duì)比度。如前所述，應(yīng)用銀增強(qiáng)通常不會(huì)造成任何困難。

增強(qiáng)后使用OsO4固定也是可能的，但由于OsO5是一種強(qiáng)氧化劑，它能夠氧化金屬銀，特別是當(dāng)以顆粒形式存在時(shí)。這導(dǎo)致部分銀被去除。一種簡(jiǎn)單的補(bǔ)救方法是將稍微增強(qiáng)的樣品與有限的OsO4固定相結(jié)合，例如1%OsO5分鐘。

我沒有得到積極的結(jié)果，現(xiàn)在怎么辦？

當(dāng)孵育的標(biāo)本看起來和對(duì)照一樣干凈時(shí)，要么（一種或多種）試劑不活躍，要么抗原被破壞、掩蓋或缺失。如通訊#4（請(qǐng)參閱本網(wǎng)站的“通訊"部分）中所述，通過使用點(diǎn)點(diǎn)測(cè)試反向進(jìn)行孵化協(xié)議測(cè)試，很容易找到原因。

首先測(cè)試所用金綴合物上的銀增強(qiáng)試劑（如果使用的話）的活性。如果銀增強(qiáng)是好的，下一步是在使用的一級(jí)抗體上測(cè)試金綴合物，等等。如果它證明問題不在試劑中，你將不得不研究抗原保存。是否應(yīng)進(jìn)行不同的固定？或者不同的嵌入介質(zhì)？使用光顯微鏡對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，無需繁瑣的EM實(shí)驗(yàn)工作即可回答這些問題。

我有背景問題；這是因?yàn)榻鸸曹梿幔?/span>

當(dāng)標(biāo)本被正確阻斷并且使用了正確的培養(yǎng)緩沖液成分和條件時(shí)，背景水平不應(yīng)干擾特定信號(hào)。某些背景總是存在的：在某種程度上，所有化合物對(duì)其他化合物都有一定的親和力，根據(jù)可用性和濃度，可能會(huì)發(fā)生相互作用。在這方面沒有絕對(duì)的黑白之分。

當(dāng)你放棄了一級(jí)抗體培養(yǎng)，只使用黃金步驟，而你的背景已經(jīng)大大降低，那么你的一級(jí)抗體就會(huì)導(dǎo)致背景。補(bǔ)救措施：通過親和層析（抗血清）和/或交叉吸附純化一級(jí)抗體。如果在不使用初級(jí)培養(yǎng)的情況下，你的背景水平不可接受，那么樣本有可能與金綴合物結(jié)合。

背景可能有許多原因，圍繞三種不同類型的相互作用：

通過在蛋白質(zhì)阻斷步驟之前使用NaBH4或氨酸阻斷步驟消除的殘余固定活性，

對(duì)疏水區(qū)域的粘性（包埋介質(zhì)、富含脂質(zhì)的樣品化合物）。這通過使用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)阻斷步驟來減少，所述蛋白質(zhì)阻斷步驟涉及部分疏水性蛋白質(zhì)，

基于電荷的相互作用導(dǎo)致帶負(fù)電荷的試劑（如抗體和金綴合物）粘附在樣品中帶相反電荷的區(qū)域（臭名昭著的是組蛋白、一些膠原類型和聚賴氨酸，有時(shí)用于使切片粘在表面）。這種類型的相互作用只能通過向培養(yǎng)基中添加過量的帶負(fù)電荷的無關(guān)分子來克服。Aurion開發(fā)了一種化學(xué)修飾的BSA，稱為BSA-c™ 特別是為此目的。通訊#1提供了深入的信息。新聞稿可在此處在線獲取。

有什么論壇我可以回答關(guān)于標(biāo)簽或顯微鏡的問題嗎？

請(qǐng)隨時(shí)通過電子郵件聯(lián)系我們的幫助臺(tái)，關(guān)于免疫標(biāo)記的問題。

有一些新聞組可能感興趣，如：生物網(wǎng)。細(xì)胞生物、生物網(wǎng)、細(xì)胞生物。細(xì)胞網(wǎng)，bionet.molbio。方法采用免疫細(xì)胞化學(xué)和生物化學(xué)方法。有一個(gè)顯微鏡ListServer，您可以訂閱它，它提供了一個(gè)平臺(tái)，可以從各個(gè)方面詢問有關(guān)光學(xué)和電子顯微鏡的問題。您可以通過向發(fā)送電子郵件進(jìn)行訂閱該消息只需包含“訂閱顯微鏡"一詞。

 

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