XSL0007 免疫熒光（石蠟-三標(biāo)）

免疫熒光

免疫熒光技術(shù)又稱為熒光抗體技術(shù)，將熒光標(biāo)記技術(shù)和免疫學(xué)方法結(jié)合起來，利用抗原抗體相互作用從而對組織或細(xì)胞內(nèi)的 抗原或抗體物質(zhì)進(jìn)行定位、示蹤、定性以及相對定量等。

實驗意義

1. 免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、敏感性高、反應(yīng)速度快、結(jié)果清晰明確，在臨床檢驗和科學(xué)研究工作上有很高的應(yīng)用價值。

2. 操作簡便，便于推廣。

免疫熒光（石蠟-三標(biāo)）

實驗步驟 一、脫蠟至水

1. 石蠟切片56℃ 預(yù)熱3h。

2. 二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ 各5min脫蠟

3. 無水乙醇Ⅰ和無水乙醇Ⅱ復(fù)水2min。

4. 95%、90%、80%、70%的乙醇各2min。

5. 去離子水洗3min。

6. 1×PBS洗3min×2次。 二、抗原修復(fù)

7. 切片置0.01M PH6.0 檸檬酸鹽緩沖液中再放入高壓鍋，蓋上蓋子及高壓閥，待有蒸汽冒出開始計時加熱 15min。（或CB液中微波中高火5min煮沸，然后中火維持沸騰20min），將高壓鍋置流水下沖洗減壓，安 全打開高壓鍋。 7’. 將切片置于0.01mol/L且ph=6.0的枸櫞酸液修復(fù)液中，用微波爐中火加熱6分鐘至微微沸騰，再用中低火 力維持10分鐘，停止加熱后自然冷卻至室溫。（煮沸6分鐘×4次可能更好）。

8. 讓載片在原檸檬酸鹽緩沖液中自然冷卻至室溫，降至室溫前切勿取出。

9. PBS浸洗2分鐘后滴加0.3%tritonX-100透膜劑透膜12分鐘（不透膜也沒關(guān)系，反正細(xì)胞早就被切開了）。但注意細(xì)胞膜表面的整合蛋白不能加tritonX-100,否則會被洗掉。

10.PBS洗3minX2次。

三、免疫標(biāo)記

1. 甩干PBS，正常山羊血清在濕盒中37℃封閉30分鐘。

2. 甩去山羊血清，勿洗，種屬來源不同的Ab1和Ab2按適當(dāng)比例混合后滴加于切片樣品位置，濕盒中4℃ 過夜（或37℃ 2h）。注意設(shè)置對照.（對照可分為陰性對照、陽性對照和空白對照，根據(jù)實驗需要設(shè) 置）。

3. 室溫復(fù)溫45min。

4. PBS洗3min×5次。

5. 甩去PBS，滴加相應(yīng)的適當(dāng)濃度的二抗（我這里使用FITC標(biāo)記的二抗與Ab1結(jié)合，TRITC標(biāo)記的二抗 與Ab2結(jié)合）。37℃濕盒中孵育1h。

6. PBS洗5min×3次。

7. 滴加 Hoechst 33342（或DAPI）避光孵育2分鐘，可對標(biāo)本進(jìn)行顯核，藍(lán)色熒光，效果佳。

8. PBS洗2min×4次

9. 封片劑封片，熒光顯微鏡觀察或顯微照相。

注意：

1. 在實驗過程中勿使切片樣品變干，以免影響實驗效果。

2. 若一張切片同時做兩種抗體的免疫熒光，則加一抗時可將兩種一抗按各自所需的濃度混合，但要注意抗 體要來源于不同的動物。加二抗時也可將兩種二抗按各自所需的濃度混合，但要注意二抗要有不同的顏 色。

3. 第7步和第7'步任選一。

免疫熒光（石蠟-三標(biāo)）

大鼠造血干細(xì)胞免疫熒光三標(biāo)圖片（圖中核標(biāo)為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記為紅色，細(xì)胞膜標(biāo)記為綠色，紅綠共標(biāo)記區(qū)為黃色，紅、 綠、藍(lán)共標(biāo)記區(qū)為白色）。

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