XSL0009 石蠟冰凍切片TUNEL凋亡熒光

石蠟冰凍切片TUNEL凋亡熒光

TUNEL凋亡熒光實(shí)驗(yàn)原理

dUTP 缺口末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL ）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理是當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)， DNA內(nèi)切酶被激活，核小體間的基因組DNA被切斷，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）加上帶有熒光素FITC標(biāo)記的dUTP，從而可以通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。

TUNEL凋亡熒光實(shí)驗(yàn)意義

1. TUNEL法是一種分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，可對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞或者凋亡小體進(jìn)行原位染色，可以準(zhǔn)確 反映細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征。

2. 可用于石蠟切片、冰凍切片、培養(yǎng)的細(xì)胞等進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)方法要高。

3. 操作簡(jiǎn)便快捷，在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。

TUNEL凋亡熒光實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 石蠟切片TUNEL顯色法：

①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，脫蠟劑二甲苯，至水劑乙醇；

 ②PBS漂洗3×5 min；

③加入蛋白酶K工作液37℃反應(yīng)15-30 min, PBS漂洗3×5 min；

④4%多.聚.甲.醛（pH7.4的PBS）室溫固定15-30 min，PBS漂洗3×5 min；

⑤浸入封閉液（3%H2O2）室溫封閉10 min，PBS漂洗3×5 min；

⑥參考使用試劑盒的說(shuō)明書配制適量的TUNEL檢測(cè)液，其中含有TdT酶、熒光標(biāo)記液、TUNEL檢測(cè)液；

⑦樣品上加入適量TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60 min，PBS漂洗3×5 min；

⑧選擇是否用DAPI復(fù)染細(xì)胞核；

⑨使用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2. 冰凍切片TUNEL顯色法：

①新鮮組織經(jīng)處理后，立即在恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)切片，厚度為5~6 μm；

②防脫玻片，貼片，室溫陰干約12 h；

③4%多.聚.甲.醛（pH7.4的PBS）室溫固定10 min，PBS漂洗3×5 min；

④浸入封閉液（3%H2O2）室溫封閉10 min，PBS漂洗3×5 min；

⑤浸入通透液（0.1%Triton X-100溶于PBS中），室溫通透30 S-2 min；

⑥參考使用試劑盒的說(shuō)明書配制適量的TUNEL檢測(cè)液，其中含有TdT酶、熒光標(biāo)記液、TUNEL檢測(cè)液

⑦樣品上加入適量TUNEL檢測(cè)液，37°C避光孵育60min，PBS漂洗3x5 min;

⑧選擇是否用DAPI復(fù)染細(xì)胞核;

⑨使用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

實(shí)驗(yàn)完成周期及交付標(biāo)準(zhǔn)

1. 實(shí)驗(yàn)周期：1-2周

2. 交付標(biāo)準(zhǔn)：蠟塊、切片、染色圖片、實(shí)驗(yàn)報(bào)告（實(shí)驗(yàn)步驟、試劑、耗材等）

需確認(rèn)的信息

1. 樣本的種屬

2. 樣本的類型（固定的組織or蠟塊or切片）

3. 是否提供試劑盒

4. 拍照要求

石蠟冰凍切片TUNEL凋亡熒光 

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