41009ES Plant Preservative Mixture(PPM)

產(chǎn)品描述

植物組織培養(yǎng)可以依階段區(qū)分為：一、引發(fā)愈傷組織( callus )，因?yàn)橹挥衏allus可以進(jìn)行組織培養(yǎng)。 二、從callus誘導(dǎo)成根或芽。組培的方式可以分為3種：1）固體培養(yǎng)，將植物組織放置于固體培養(yǎng)基上，通常培養(yǎng)在玻璃瓶或塑膠瓶?jī)?nèi)。2）平板培養(yǎng)，將植物組織埋于固體培養(yǎng)基中，并且培養(yǎng)在培養(yǎng)皿。3）液體培養(yǎng)，將植物組織培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，一般來(lái)說(shuō)培養(yǎng)在生物反應(yīng)器內(nèi)，可以再細(xì)分為靜止培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和漂浮培養(yǎng)。在整個(gè)組織培養(yǎng)的過(guò)程，最擔(dān)心的就是微生物的污染，所以用于植物組織培養(yǎng)的抗菌與抗真菌劑是非常必須的。

植物組培抗菌劑（Plant Preservative Mixture, PPM）是一種廣譜抗微生物劑，可以殺死細(xì)菌和真菌細(xì)胞，防止真菌孢子的萌發(fā)，并在較高濃度下能消除內(nèi)源性污染的外植體。研究表明PPM活性成分可以穿透真菌或細(xì)菌細(xì)胞壁，抑制檸檬酸循環(huán)和電子傳遞鏈等中心代謝循環(huán)中的關(guān)鍵酶的活性，并且可以抑制培養(yǎng)基中的單糖和氨基酸向真菌和細(xì)菌細(xì)胞的運(yùn)輸。PPM能有效地抑制植物細(xì)胞和植物組織培養(yǎng)中的通過(guò)空氣、水、人傳播的微生物污染及內(nèi)源性污染，而不會(huì)影響體外種子發(fā)芽、愈傷組織增殖和愈傷組織的再生。

產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)

與普通的抗生素相比，優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：

1）是一種廣譜、高效抗菌/抗真菌劑。

2）比常用抗生素價(jià)格更低廉，可以作為植物組織培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)成分，并可作為常規(guī)使用。

3）因?yàn)樗陌袠?biāo)是抑制多種酶，所以產(chǎn)生抗耐藥性的突變體是不可能的。

4）具有熱穩(wěn)定性，可以和培養(yǎng)基一起滅菌。

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸，4℃保存，有效期兩年。

使用方法

以下所述的操作流程是通用的，可能需要根據(jù)待處理的特定物種稍作改動(dòng)。

1.含有PPM的培養(yǎng)基可以在超凈臺(tái)外面分裝，即無(wú)需無(wú)菌操作，等瓊脂凝固后把蓋子蓋好。如果用泵來(lái)分裝培養(yǎng)基，建議在分裝前后先用高壓滅菌處理的熱水清理導(dǎo)管/軟管。

2.如果儲(chǔ)存在無(wú)菌容器或在此之前儲(chǔ)備液未受污染，含PPM的熱敏感或熱穩(wěn)定的液體培養(yǎng)基無(wú)需經(jīng)微孔濾膜或高壓滅菌處理。但是對(duì)于含有200 mg/L或更多氨基酸或蛋白質(zhì)的富集培養(yǎng)基，建議加入PPM后用濾膜過(guò)濾處理。

3.超凈工作臺(tái)里的器具（鑷子或）無(wú)需在火焰上燒，只要定期地在70%酒精里蘸一下即可。超凈工作臺(tái)無(wú)需驗(yàn)證，可以在超凈工作臺(tái)外面的干凈臺(tái)面上操作，不超過(guò)一小時(shí)即可。

4. PPM溶液呈酸性，pH 3.8，需保存在4℃。低接種密度下推薦工作劑量0.05-0.2%（v/v），可在滅菌前或滅菌后加入培養(yǎng)基，防止通過(guò)空氣傳播污染或內(nèi)源性污染。處理內(nèi)源性污染或獲得無(wú)農(nóng)桿菌的植物材料需要高劑量的PPM。

5.對(duì)于一些常規(guī)情況下表皮上被大量細(xì)菌或真菌孢子污染的種子來(lái)說(shuō)，PPM的抗菌效率可能比較弱。對(duì)于體外萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，種子應(yīng)該按照傳統(tǒng)的方法先用漂白劑進(jìn)行表面消毒。因此，在含有PPM的萌發(fā)培養(yǎng)基里，在一個(gè)非滅菌的容器中種子可以在自來(lái)水下沖洗然后在超凈臺(tái)中吹干。如果所使用的器具末端接觸到活性細(xì)菌、真菌組織或其它懷疑被污染的東西，這些器具應(yīng)該通過(guò)高壓或電子加熱設(shè)備進(jìn)行滅菌。

6.一般劑量水平：

除了內(nèi)源性污染以外，推薦劑量是0.05-0.2%。對(duì)于愈傷增殖、器官形成和胚胎形成，推薦的劑量范圍是0.05-0.075%。低接種密度或者處理緩慢生長(zhǎng)的細(xì)菌條件下，在培養(yǎng)基滅菌前或滅菌后加入此劑量的PPM，可防止空氣傳播的污染和內(nèi)源性污染。要消除更高密度的內(nèi)源性污染，需要增加PPM的劑量（參考7-內(nèi)源性污染）。

7.內(nèi)源性污染

a）對(duì)于外植體：以1cm（或更短）外植體為例，添加4~5% PPM到MS基礎(chǔ)鹽中，但千萬(wàn)不要添加Tween 20和 pH調(diào)整劑，攪拌4~12小時(shí)之后直接拿出。不用清洗，直接插入含有PPM的培養(yǎng)基里，若是草本植物換至0.05~0.1%PPM的萌發(fā)培養(yǎng)基即可；而木本植物則換至0.2% PPM的萌發(fā)培養(yǎng)基。

注意：以下從第7段（b）到10用于觀賞植物。

b）對(duì)于塊莖，球莖和鱗狀物：把整個(gè)塊莖/球莖/鱗狀物在漂白劑里搖或攪拌。然后用水沖洗（可以在非無(wú)菌條件下操作）。把塊莖/球莖切成小片，在含有4-5%PPM的全基鹽中搖或攪拌12-24 h，不要加pH調(diào)整劑和Tween 20。不用沖洗直接插入到含有0.1-0.2% PPM的培養(yǎng)基中。

8.如果按照以上操作流程沒(méi)有取得滿意的結(jié)果（尤其是厚的和非常密集的外植體、種子），我們建議按照以下流程：
a）在水中搖或攪拌外植體（較軟的組織1h，較堅(jiān)硬的組織2h）；

b）在含有50% PPM的MS基礎(chǔ)鹽中（不加pH調(diào)整劑和Tween 20）搖或攪拌5-10 min。
c）無(wú)需沖洗，直接把處植體插入到培養(yǎng)基中。如果真菌污染，可以選擇額外再加入PPM到培養(yǎng)基中。然而，對(duì)于細(xì)菌或混合污染，第一個(gè)月在培養(yǎng)基中加入0.05-0.2%的PPM是必要的。不要丟棄高度氧化的外植體，因?yàn)榇蠹s50%的外植體在4-6周內(nèi)即可恢復(fù)正常。

9.為了消除“組培中”污染的植物材料（搶救措施）：

注意：僅適合明顯觀察到受污染不超過(guò)一周的組織。

a）在自來(lái)水細(xì)水流下面用牙刷清洗材料。在含有50% PPM（用滅菌水稀釋）中搖或攪拌5-15 min。對(duì)于細(xì)菌或混合污染，我們建議用低pH值2.8-3.2的溶液，即100% PPM與0.6g/L的檸檬酸溶液（用滅菌水）按1：1混合。

b）不用沖洗直接把處理好的材料插入到含有0.05-0.2% PPM的培養(yǎng)基里，培養(yǎng)至少一個(gè)月。天弱光培養(yǎng)，如上所提，不要丟棄高度氧化的外植體，等4-6周以后將約有50%的材料恢復(fù)。

對(duì)于真菌孢子或細(xì)菌位于外植體極深的部位，而PPM無(wú)法接觸到的情況，需要把材料在水中浸泡一段時(shí)間，然后沿著外植體切片，在50% PPM中搖或攪拌5-15 min。通過(guò)以上消毒步驟，保證PPM能夠充分接觸到外植體的整個(gè)表面。

10.去除農(nóng)桿菌：

共培養(yǎng)之后，用水沖洗葉盤。然后把轉(zhuǎn)染的葉盤在含有100% PPM的基礎(chǔ)鹽中蘸（整個(gè)葉盤）約2 min。 用兩張無(wú)菌紙巾吸干放到含有常用抗生素的培養(yǎng)基上。三周后，轉(zhuǎn)到只含有0.05-0.075% PPM的培養(yǎng)基上。

注意事項(xiàng)

1）采用PPM消毒后轉(zhuǎn)移的材料，我們建議把外植體地插入半固體培養(yǎng)基中。

2）50% PPM溶液能重復(fù)利用大約5-10次。重復(fù)利用的次數(shù)取決于所處理外植體的體積和接種密度。保存50% PPM在4℃以延長(zhǎng)它的活性。如有必要，準(zhǔn)備兩種PPM消毒液：一種是滅菌內(nèi)源性污染，第二種是滅菌“組培中”的污染。用第二種消毒溶液處理材料后都要用0.2 μm的濾膜濾滅，濾滅過(guò)程可以非無(wú)菌條件下完成。一個(gè)濾器能用于溶液濾滅的整個(gè)過(guò)程。

3）如果用50% PPM處理材料效果仍不佳，可以用100% PPM。處理方法跟50% PPM相似，但處理時(shí)間不要超過(guò)10 min。

4）PPM 的使用為任何一個(gè)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)便利，并極大地提高技術(shù)人員和實(shí)驗(yàn)室的工作效率。但每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的工作條件不同可能使得PPM效力的發(fā)揮具有一定的波動(dòng)性。建議工作人員根據(jù)以上步驟操作的前提下，并進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整以確認(rèn)PPM效力發(fā)揮的最佳工作條件，或者確認(rèn)PPM是否能滿足其特定的應(yīng)用要求。整體來(lái)說(shuō)，PPM是能夠非常有效的預(yù)防植物樣本受到的空氣污染，水介質(zhì)污染以及人源接觸帶來(lái)的各種污染。使用得當(dāng)，PPM可以拯救內(nèi)源性污染的外植體；推薦劑量（0.05-0.2%（v/v））下PPM幾乎不造成任何負(fù)面損傷。

5）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
6）本產(chǎn)品僅作科研用途！
 

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