巨細(xì)胞病毒抗體IgM（CMVAb-IgM）檢測(cè)[測(cè)定方法]ELISA法[方法學(xué)原理]在微孔表面包被純化的巨細(xì)胞病毒抗原。被稀釋過(guò)的患者血清加入微孔中。如存在巨細(xì)胞病毒抗體—IgM可與微孔上抗原相結(jié)合。然后洗去未結(jié)合物質(zhì)，再加入酶聯(lián)液，與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。洗去過(guò)量【詳細(xì)】

制備好DNA文庫(kù)后，用標(biāo)準(zhǔn)方法將DNA電轉(zhuǎn)人大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化株并保存，然后制備噬菌體用于分析和篩選。在液體培養(yǎng)基中將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。經(jīng)過(guò)在液體培養(yǎng)基中的增殖，一些菌液用于甘油保種，剩下的用于制備噬菌體?；蛘呖梢酝ㄟ^(guò)將整個(gè)轉(zhuǎn)【詳細(xì)】

使用與其他噬菌體展示方法相同的步驟來(lái)對(duì)制備出的文庫(kù)的文庫(kù)容量和多樣性進(jìn)行鑒定。為了在篩選后得到序列與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，應(yīng)保證在噬菌粒文庫(kù)中存在合理水平的過(guò)量，以確保在篩選步驟中所有克隆都能被取樣，這一點(diǎn)是很重要的。我們通常力爭(zhēng)讓文庫(kù)容量比理論上的【詳細(xì)】

[器材和試劑]●ABl377型測(cè)序儀●ABI的BigDye染液●ABl9700型PCR儀器●ABI藍(lán)色葡聚糖/EDTA上樣緩沖液●3mol/L的乙酸鈉●95％及70％的乙醇●0．4pmol/ul的fUSE5“超級(jí)反向”引物，或T7“超級(jí)上游”引物●一臺(tái)帶Qiagen2X96平板轉(zhuǎn)子或同等轉(zhuǎn)子的Qiagen4K15C型離心【詳細(xì)】

在篩選和測(cè)序后，下一步是將單克隆的結(jié)合性用以下三種形式顯示出來(lái)：首先，得自靶標(biāo)器官的、相對(duì)于無(wú)插入序列的噬菌體及其他器官和組織而數(shù)量增加的噬菌體；其次，在器官或組織的脈管系統(tǒng)上進(jìn)行免疫組化和免疫熒光染色時(shí)的陽(yáng)性染色；第三，我們合成、注射以及【詳細(xì)】

[器材和試劑]●PBBST（PBS，0．1％BSA，0．1％Tween-20）●磁分離儀（Dynal）●f1Rl紫外滅活噬菌體●洗脫緩沖液（用甘氨酸將0．1mol/LHCl調(diào)整到pH2．2，1mg/mlBSA）●2rn01/LTris-HClpH9．0●LB-瓊脂培養(yǎng)基（1％細(xì)菌用胰蛋白胨，0．5％酵母提取物，1．5％細(xì)菌【詳細(xì)】

[器材和試劑]●噬菌體緩沖液●XLl-Blue或者DH5。F，TB細(xì)胞●IPTG（30mg/m1儲(chǔ)存液，水溶液；儲(chǔ)存在-20℃）●LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/X-gal/IPTG●Luria-Bertani（LB）[L-液體培養(yǎng)基（1％細(xì)菌用胰蛋白胨，0，5％酵母提取物，0．085m01/LNaCl，pH7．2）]●LB+Amp（L-【詳細(xì)】

[器材和試劑]●LB+Amp●LB+Amp/Glu[LB，50ug/mlAmp，l％葡萄糖]●IPTG●M13K07輔助噬菌體（Stratagene）●PEG8000（Sigma）●NaCl●TBS●SW40異質(zhì)同晶聚合物管（Beckman）[方法]1．將含有單克隆噬菌粒的菌落接種到10ulLB+Amp/Glu中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)（在lac啟動(dòng)【詳細(xì)】

[器材和試劑]●直徑為60mm的聚苯乙烯培養(yǎng)皿（Falcon1007）●包被緩沖液●單克隆抗體（mAb）57D1。該抗體能識(shí)別M13噬菌體次要衣殼蛋白（pⅢ）N末端。它是用M13噬菌體顆粒免疫大鼠而獲得的。來(lái)自含57D1雜交瘤細(xì)胞的上清用50％（NH4）2SO4沉淀，然后在PBS中溶解【詳細(xì)】

互補(bǔ)DNA（cDNA）克隆基因的表達(dá)是基因分離與鑒定的一個(gè)極為有效的工具。用于篩選的核苷酸探針需要所感興趣基因的原始序列信息，而對(duì)于表達(dá)cDNA文庫(kù)的篩選只需要一個(gè)天然的配體或一個(gè)特異的抗體（單克隆或多克?。┳鳛樘结?。體外篩選入噬菌體或質(zhì)粒展示的cDNA【詳細(xì)】

[器材和試劑]通用設(shè)備及試劑●滅菌水●無(wú)菌微量離心試管●無(wú)菌移液槍及移液管槍頭●微型離心機(jī)●臺(tái)式離心機(jī)A部分●無(wú)菌的0．2ml的細(xì)壁聚丙烯微型離心管●pfuDNA聚合酶（Stratagene）●10×pfu緩沖液，由提供PfuDNA聚合酶的廠(chǎng)商提供●dNTP混合液（每個(gè)10mmol/L【詳細(xì)】

[器材和試劑]●PBST●牛血清蛋白（BSA）（Sigma）●抗血清及gⅥ—cDNA噬菌體文庫(kù)●無(wú)菌15ml聚丙烯管（Falcon）●立式旋轉(zhuǎn)機(jī)●蛋白A—瓊脂糖凝膠珠（AmershamBiosciences）●無(wú)菌0．1mol/L鹽酸甘氨酸，pH2．2加0．1%（w/v）BSA●無(wú)菌2mol/LTris堿（未調(diào)節(jié)pH）【詳細(xì)】

[器材和試劑]●通用設(shè)備及試劑以及以下的設(shè)備和試劑：●無(wú)菌96孔帶蓋培養(yǎng)板（Costar）●LBAT●R408輔助噬菌體（Stratagene）●振蕩孵育箱●96孔復(fù)制板●PEG/NaCl（●PBS[方法]1．將克隆體接種到100ulLBAT96孔培養(yǎng)板上，并在37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)（180r/min）。2．【詳細(xì)】

總體上，可以構(gòu)建兩大類(lèi)抗體文庫(kù)：免疫文庫(kù)或天然文庫(kù)。免疫文庫(kù)是用免疫球蛋白（Ig）可變區(qū)（V）基因制備而成的，這些基因或來(lái)自免疫人群，或來(lái)自小鼠；其中的V基因高度偏向于能識(shí)別免疫原的抗體。因而，免疫文庫(kù)中分離的抗體親和力，遠(yuǎn)高于那些分離自同等規(guī)【詳細(xì)】

天然V區(qū)可以被看作是在經(jīng)歷過(guò)或未經(jīng)歷過(guò)抗原刺激的淋巴細(xì)胞中所發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。結(jié)果，有些擴(kuò)增的V基因?qū)?huì)是重排的肝系基因，而另外的則含有B細(xì)胞與抗原相遇所誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變體。這些基因擴(kuò)增所用引物可以識(shí)別V基因的5’端scFv單鏈抗體和J基因的3’端或者是CI。【詳細(xì)】

器材和試劑]●PCR試劑和設(shè)備●1ug任何舍有scFv及（GIy4Ser）3接頭的載體●RHuJH引物、RHuVκ引物和RHuVλ引物，10pmol/ul[方法]1．在0．5ml微量離心管內(nèi)配制用于擴(kuò)增的主混合液。所顯示的主混合液用于VH—Vκ接頭。對(duì)于VH—Vλ接頭的主混合液，n＝29。單個(gè)反【詳細(xì)】

器材和試劑]●PCR試劑和設(shè)備●Geneclear試劑盒（Qbiogene，Inc．）●V區(qū)特異性正向（JΚFOR和JΛFOR）和反向（VuBACK）PCR引物●scFv接頭DNA[方法]1．在0．5ml微量離心管內(nèi)配制以下PCR反應(yīng)混合液。配制成2個(gè)“反應(yīng)管”，1個(gè)含有V。文庫(kù)DNA，另1個(gè)則含有Vl文庫(kù)【詳細(xì)】

[器材和試劑]●T4DNA連接酶及10×緩沖液（NEB）●酚/氯仿（Sigma）●100%和70%乙醇，-20℃保存●消化的載體和scFv文庫(kù)●TE（10mmol/LTrispH8，lmmol/LEDTA）[方法]1.如下所述，配制兩個(gè)100ul連接混合液，其中1個(gè)用于VH-VκscFv文庫(kù)，另1個(gè)用于Vu-VλscFv文庫(kù)，【詳細(xì)】

[器材和試劑]●大腸桿菌TGl菌株（Stratagen）●37℃孵育箱（NewBrunswickScientmc）●SorvatlRC5離心機(jī)（或同類(lèi)型），GS3轉(zhuǎn)頭（均在4℃預(yù)冷）●預(yù)冷的500m1聚丙烯離心管●2L有擋板錐形瓶●基本培養(yǎng)瓊脂板[105gK2HP04、4．5gKH2P04、1g（NH4）2S04、0．5gNa3C6【詳細(xì)】

YY11664瓊脂糖凝膠4FFBR進(jìn)分英文名稱(chēng)：Sepharose4FFExclusionlimit：forglobularproteins：～3×107ａndfordextrans：～6×106Meanparticlesize：90umBeadsizerange：45～165umBeadstructure：highlycross-linkedagarose,4%or6%,respectively,sphericalFlowrate【詳細(xì)】