深圳市安培生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第5年

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血清系列
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qPCR中的絕對(duì)定量是什么？2021/10/14
絕對(duì)定量目的是使用PCR測(cè)定目的基因在樣本中的數(shù)量，即拷貝數(shù)。在絕對(duì)定量中，想要得到目的基因的拷貝數(shù)，需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖需要將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR。標(biāo)準(zhǔn)品是已知濃度...
qPCR中的相對(duì)定量是什么？2021/10/14
相對(duì)定量常用于測(cè)定兩個(gè)不同樣品中靶基因量的差異，例如使用實(shí)時(shí)RT-PCR法定量檢測(cè)mRNA水平的實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)分析兩個(gè)不同樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)，需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，設(shè)置其中一個(gè)樣品的靶基因表...
什么是多重PCR？2021/10/14
多重PCR反應(yīng)是指在單次PCR反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增一種以上的靶基因。現(xiàn)有多種熒光染料可使用，使得運(yùn)行多重實(shí)時(shí)熒光PCR成為可能。如能同時(shí)檢測(cè)薪冠、甲流、乙流的核酸檢測(cè)試劑盒，實(shí)驗(yàn)原理就是多重PCR。常見(jiàn)的熒...
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化（六）2021/10/14
引物和探針的濃度也需要尋找*濃度，這通常憑借經(jīng)驗(yàn)決定。為什么要尋找*濃度呢？因?yàn)橄馮aqman探針在反應(yīng)過(guò)程中會(huì)被破壞，需要在起始濃度便保留足量的探針。這個(gè)濃度通常是在反應(yīng)體系中達(dá)到250nmol/L...
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化（五）2021/10/12
想要提高探針的的效果，可以考慮在探針上采用LNA（鎖核酸）堿基或MGB（小溝結(jié)合劑）基團(tuán)。這樣做的效果是：1、增強(qiáng)探針與靶序列的雜交強(qiáng)度。增強(qiáng)結(jié)合的特異性后，背景噪聲降低，從而提高整個(gè)實(shí)驗(yàn)的靈敏度。2...
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化（四）2021/10/12
這期我們來(lái)學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)TaqMan探針，應(yīng)該考慮的因素有以下這些......1、TaqMan探針的最佳長(zhǎng)度在20bp，不超過(guò)30bp，這樣才能實(shí)現(xiàn)熒光淬滅。有些情況下超過(guò)30bp也是可以的，需要將淬滅基團(tuán)...
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化（三）2021/10/12
本期介紹設(shè)計(jì)引物，得到實(shí)時(shí)熒光PCR引物對(duì)，這種方法也可以用于普通PCR。1、長(zhǎng)度應(yīng)該在18～30bp，保證結(jié)合的特異性。2、熔解溫度（Tm值）應(yīng)在55～60°C，兩條引物的Tm值應(yīng)相差2～3°C。3...
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化（二）2021/10/12
如果你所研究的靶序列有前人建立過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，就可以在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中查找，查看擴(kuò)增效率、特異性、靈敏度等信息，省去從頭開(kāi)始的時(shí)間。注意，使用前人建立的方法前，需要再次驗(yàn)證這個(gè)方法的參數(shù)是不是...
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化（一）2021/10/12
如果是病毒定量和SNP基因分型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，我們需要盡可能高特異性；如果是病原體、mRNA檢測(cè)，我們需要高靈敏度。想要提高PCR擴(kuò)增效率、特異性及靈敏度，我們可以通過(guò)一系列措施優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光定量...
qPCR實(shí)驗(yàn)為什么要制作熔解曲線(xiàn)？2021/10/11
熒光DNA結(jié)合染料法的缺點(diǎn)是它們能在反應(yīng)中結(jié)合所有DNA雙鏈，包括在實(shí)時(shí)熒光PCR中產(chǎn)生的引物二聚體，和其他非特異性產(chǎn)物，引起大量的背景噪聲信號(hào)。這種噪聲會(huì)影響我們對(duì)靶基因產(chǎn)量的評(píng)估，甚至熒光強(qiáng)度和靶...
經(jīng)濟(jì)快捷的SNP位點(diǎn)研究方法-SNP基因分型2021/10/11
SNP，全稱(chēng)SingleNucleotidePolymorphisms，是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異。目前很多人仍然使用測(cè)序法來(lái)進(jìn)行研究，具有準(zhǔn)確、直觀的優(yōu)點(diǎn)。但有一種方法，能間接的研究SNP，且經(jīng)...
生化轉(zhuǎn)染的另一種選擇，磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染2021/10/11
磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法應(yīng)用于將外源DNA轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的細(xì)胞，已有45年以上的歷史。Graham和vanderEb在磷酸鈣存在下，將病毒DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的這一工作，為基因在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)...
共轉(zhuǎn)化，篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的實(shí)用工具2021/10/11
想要達(dá)到轉(zhuǎn)染的目的，即分析轉(zhuǎn)染基因的功能和表達(dá)，需要轉(zhuǎn)染的基因穩(wěn)定整合進(jìn)入宿主染色體。根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，細(xì)胞群體中，最高有80%的細(xì)胞，以瞬時(shí)表達(dá)的方式表達(dá)轉(zhuǎn)染的基因。但對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，好的情況，也只有1/...
如何提高磷酸鈣轉(zhuǎn)染的效率？2021/10/11
提高磷酸鈣轉(zhuǎn)染法效率的共通步驟，目的都是為了避免產(chǎn)生會(huì)被細(xì)胞內(nèi)吞、加工失效的大顆粒沉淀。提高轉(zhuǎn)染效率的操作有以下這些：1、將小分子DNA整合在高分子質(zhì)量基因組DNA上，以大分子作為運(yùn)載體，能提高轉(zhuǎn)染效...
怎么提高電穿孔法轉(zhuǎn)染的效率？2021/10/9
電穿孔法難點(diǎn)在于提高電穿孔的效率。實(shí)驗(yàn)操作者一般能從電轉(zhuǎn)儀廠家得到轉(zhuǎn)染的詳細(xì)方案和優(yōu)化指導(dǎo)。當(dāng)你需要自己優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率時(shí)，可以從以下方面進(jìn)行：1、外加電場(chǎng)的強(qiáng)度：電壓過(guò)低，細(xì)胞膜不能形成小孔，使得外源分...
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